Approche intégrée couplant procédé microbiologique et procédé séparatif in situ pour la production d’acide 3-hydroxypropionique par Lactobacillus reuteri - AgroParisTech Access content directly
Theses Year : 2015

Integrated approach coupling microbiological process and in situ product recovery for the production of 3-hydroxypropionic acid by Lactobacillus reuteri

Approche intégrée couplant procédé microbiologique et procédé séparatif in situ pour la production d’acide 3-hydroxypropionique par Lactobacillus reuteri

Abstract

Within the development of bioeconomy, there is an increasing drive towards the production of chemicals from renewable biomass-derived feedstock. In this context, interest in the sustainable production of biobased building blocks, such as the bifunctional 3-hydroxypropionic acid (3-HP), is growing. Among its various applications, the 3-HP can be used for the synthesis of biobased polymers and acrylic acid. The development of a biotechnological process to produce this platform chemical is a key issue. Lactobacillus reuteri is known as a natural producer of 3-HP from glycerol (by-product of biodiesel manufacturing industries) although at low yield and productivity, due to the inhibitory effects of the product and of its metabolic intermediate 3-hydroxypropionaldehyde (3-HPA), as well as the formation of 1,3-propanediol (1,3-PDO) as co-product. The integration of an in situ 3-HP extraction process to the bioconversion system could lead to a decrease in inhibition phenomena and to the continuous recovery of the targeted molecule. To this aim, the reactive liquid-liquid extraction assisted by a membrane contactor was considered in the present study. This technique shows a high specific surface area, unrivaled when compared to usual dispersive processes, without creating emulsion and limits the direct contact between bacteria and the organic phase. First, three L. reuteri strains, representative of the intra-species diversity, were studied in flasks and compared in terms of growth performance on glucose and of 3-HP production using glycerol as substrate. The DSM 17938 strain, a good glycerol consumer and 3-HP producer, was then selected for the project. During bioconversion, a total loss in cultivability concomitant with a decrease of the cellular enzymatic activity was observed. Flow cytometry analyses revealed a great impact of 3-HPA and, to a lesser extent, of 3-HP only in acidic conditions. To optimize 3-HP production performances and further understand its metabolic determinants, bioconversion was set up in bioreactor with a controlled feeding in glycerol (fed-batch mode). Concerning the 3-HP extraction, the use of a mixed extractants (tri-octyl-amine and Aliquat 336 in n-decanol) showed high performances over a wide range of experimental conditions (pH, 3-HP concentration), highlighting a synergistic effect. 3-HP was predominantly extracted over all the molecules of the bioconversion medium, confirming the selectivity of the extraction process studied. Nevertheless, when extraction was performed on a real bioconversion broth, some cell-originating compounds were suspected to adsorb to the interface between the two phases near the pores of the membrane. This effect, combined to the possible competition between 3-HP and other compounds able to react with the extractants, such as salts, led to limitations in the extraction performances and selectivity. To our best knowledge, this work is the first one dedicated to the study of 3-HP extractive bioconversion. However, this new integrated process currently displays low performances (productivity, final product concentration, production duration) due to bacterial inhibition by the bioconversion metabolites and the extractant organic phase. Several optimization tracks have been suggested to overcome the identified locks.
La synthèse de produits chimiques à partir de ressources renouvelables est une préoccupation majeure qui contribue au développement de la bioéconomie. En effet, un intérêt croissant est porté à la production durable de molécules plateformes biosourcées, comme l’acide 3-hydroxypropionique (3-HP), un acide carboxylique hydroxylé. Le développement de procédés biotechnologiques de production du 3-HP se heurte à plusieurs verrous. La bactérie lactique Lactobacillus reuteri a été identifiée comme productrice naturelle de 3-HP à partir de glycérol (co-produit de l’industrie du biodiesel), mais avec de faibles productivité et titre, en raison des effets inhibiteurs de la molécule d’intérêt et de son intermédiaire métabolique, le 3-hydroxypropionaldéhyde (3-HPA). Le rendement de production est quant à lui limité par la formation de co-produits, comme le 3-HPA et le 1,3- propanediol (1,3-PDO). L’intégration d’un procédé d’extraction in situ du 3-HP avec le système de bioconversion pourrait conduire à une diminution de l’inhibition et à une récupération en continu de la molécule ciblée. Pour cela, l’extraction réactive liquide-liquide assistée par contacteur à membrane a été identifiée comme une technique d’intérêt. Elle permet de mettre en oeuvre une surface d’échange spécifique bien supérieure en comparaison aux procédés dispersifs usuels, empêche la formation d’une émulsion et permet de limiter le contact direct des cellules avec la phase organique extractante, potentiellement toxique. Trois souches de L. reuteri, représentatives de la diversité intra-spécifique, ont d’abord été étudiées en fioles et leurs performances de croissance sur glucose et de bioconversion du glycérol en 3-HP ont été comparées. La souche DSM 17938, bonne consommatrice de glycérol et productrice de 3-HP, a été sélectionnée pour la suite du projet. Durant la bioconversion, une perte totale de la cultivabilité cellulaire, concomitante à une diminution de l’activité enzymatique des bactéries productrices a été observée. Des analyses spécifiques par cytométrie en flux ont alors révélé un impact délétère du 3-HPA et, dans une moindre mesure, du 3-HP uniquement en conditions acides. Dans le but d’optimiser les performances de production du 3-HP et de mieux en comprendre les déterminants métaboliques, la bioconversion a été mise au point en bioréacteur et un apport contrôlé de glycérol (mode "fed-batch") a été développé, permettant de diminuer l’accumulation de 3-HPA dans le milieu. Concernant l’extraction du 3-HP, l’utilisation combinée de tri-octyl-amine (TOA) et d’Aliquat 336 dilués dans du n-décanol a conduit à des performances élevées (rendement d’extraction maximum supérieur à 90 %) sur une gamme de conditions expérimentales compatibles avec la bioconversion (pH, concentration en 3-HP). Une synergie entre les deux amines extractantes a été mise en évidence. Le 3-HP est extrait de façon prédominante par rapport aux autres métabolites de la voie de bioconversion, confirmant la sélectivité du procédé de séparation choisi. Cependant, lorsque l’extraction est réalisée sur un milieu réel de bioconversion, certains composés d’origine cellulaire sont suspectés de s’adsorber à l'interface entre les phases au niveau des pores de la membrane. Cet effet, combiné à la possible compétition entre le 3-HP et des composés (sels) également capables de réagir avec les extractants, a conduit à des limitations en termes de rendement, de cinétique d’extraction et de sélectivité. A notre connaissance, ce travail constitue la première étude dédiée à la bioconversion extractive du 3-HP. Toutefois, ce nouveau procédé intégré montre encore de faibles performances (productivité, concentration finale, durée de production), en raison d’une inhibition importante des bactéries productrices par les métabolites de la voie de bioconversion et la phase organique extractante. Différentes pistes d’optimisation ont été suggérés pour surmonter les différents verrous identifiés.
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Grégoire Burgé. Approche intégrée couplant procédé microbiologique et procédé séparatif in situ pour la production d’acide 3-hydroxypropionique par Lactobacillus reuteri. Sciences du Vivant [q-bio]. Ecole doctorale ABIES (Agriculture, Alimentation, Biologie, Environnement, Santé), 2015. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-01787709⟩
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